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ポリビニルポリピロリドン（Polyvinylpolypyrrolidone）｛ピーブイピーピー（ PVPP）｝処理 グローバックサンプル（growback）の５００マイクロリットル（500 ul）のア リコート（aliquot）がピーブイピーピー｛クアリコン社（Qualicon, Inc.）｝ の５０ｍｇのタブレットを含むチューブに追加された。該チューブはボルテック ス（vortexed）されそして該ピーブイピーピーは１５分間澄むようにされた。最 終浮遊物は次いで溶解過程で使用される。 サルモネラサンプルの準備 ２ｍｌのスクリューカップチューブ（screw cup tube）で、強化すなわちピー ブイピーピー処理サンプルの５マイクロリットルがデーエヌエイ挿入染料エスワ イビーアールグリーン（DNA intercalating dye SYBR R Green）｛モレキュラー プローブ（Molecular Probes）｝の１：１０、０００希釈を含む溶解試薬｛５ｍ ｌビーエイエックス溶解バッフアー（5ml BAX R lysis buffer）と６２．５ｕｌ （マイクロリットル）ビーエイエックスプロテアーゼ（62.5 ul BAX R Protease ）｝の２００ｕｌ（マイクロリットル）に加えられた。該チューブは３７℃で２ ０分間次いで９５℃で１０分間培養された。９５℃の培養の後、４ｍｇ／ｍｌの ビーエスエイ（BSA）溶液の５０ｕｌ（マイクロリットル）が該溶菌液（lysate ）に追加された。これはピーブイピーピー処理済みと未処理のサンプルに行われ た。対照として、幾つかのサンプル未処理で残された。この未精製バクテリヤ溶 菌液の５０マイクロリットルが、パーキンエルマー７７００シークエンスデテク ター計器（Perkin Elmer 7700 Sequence Detector instrument）で使用されるピ ーシーアールチューブ内に含まれた１つのビーエイエックスサルモネラサンプル タブレット（BAX R Salmonella sample tablet）を水和するため使用された。該 チューブはキャップを付けられ、パーキンエルマー９６００サーマルサイクラー （Perkin Elmer 9600 thermal cycler）内で次のプロトコルに依り熱サイクルに かけられた。 ９４℃ ２．０分 １サイクル ９４℃ １５秒 ３５サイクル ７２℃ ３．０分 ７２℃ ７分 １サイクル ４℃ ”長期間（forever）” 増幅後分析（Post Amplification Analysis） 増幅後、下記条件で運転することによりパーキンエルマー７７００デーエヌエ イシークエンスデテクター（Perkin Elmer 7700 DNA Sequence Detector）上で 該溶解曲線が作られた。 プレートの種類： シングルリポーター（Single Reporter） 器械： ７７００シークエンスデテクションシステム（7700 S equence Detection System） 運転： 実時間 染料層： エフエイエム（FAM） サンプルの種類： 未知である サンプル容積： ５０ｕｌ（マイクロリットル） 運転条件： ７０℃ ２分１サイクル データ収集せず ６８℃ １０秒９８サイクル データ収集する 自動インクレメント ＋０．３℃／サイクル ２５℃ ”長期間” 該多成分データは該器械から移出され該分析に使用された。特定のデーエヌエ イフラグメントの製作は該アンプリフアイ（amplified）されたサンプルにビー エイエックスローデイングダイ（BAX R Loading Dye）の１５マイクロリットルを 添加することにより検証された。次いで１５マイクロリットルのアリコートが臭 化エチジウムを含む２％アガロースゲル（agarose gel）のウエル（well）内に 装填された。該ゲルは３０分間１８０ボルトで運転された。特定の生成物は次い でユーブイトランスイルミネーション（UV transillumination）を使用して可視 化された。 データ分析 生の蛍光量（raw fluorescence）データが処理用にマイクロソフトエクセル（ Microsoft Excel）に移入された。この段階からデータを可視化し該データから 予測をするため分岐的取り組みが使用された。 データ事前処理（Data Preprocessing） 蛍光ノイズを減らすために該データを事前処理することは成功するモデリング の尤度（likelihood）を増すことが実験的に決定された。該データ事前処理は次 の過程から成り、すなわち、 ａ．蛍光データ（fluorescence data）の正規化、 ｂ．０．１℃の解像度でキュービックスプライン関数（cubic spline functio n）を用いた該正規化蛍光の内挿補間、 ｃ．内挿補間された蛍光スペクトラムの対数を取る、 ｄ．２５点サビツスキーゴレイ平滑化関数（25 point Savitsky Golay smooth ing function）を用いた該蛍光の対数の平滑化、 である。 最終温度スペクトラムはここで説明されるモデリング方法への入力の集合とし て使用される。該温度スペクトラムを使用した２つの異なるモデリング例を説明 する。 過程ａ．データの正規化と可視化 該蛍光データは、最初にスペクトラム内の最低測定蛍光レベルを決定し、この 値を、直流オフセットを除くために、該スペクトラム内の各点から引くことによ り正規化される。上記の過程ａ．の正規化されたデータは次いでサビツスキーゴ レイの平滑化アルゴリズム(Savitzky-Golay smoothing algorithm)で平滑化され る。温度に対する平滑化蛍光の負の導関数｛−ｄｌｏｇ（Ｆ）／ｄＴ｝が取られ 、−ｄｌｏｇ（Ｆ）／ｄＴ（ｙ軸）対温度（ｘ軸）としてプロットされる。 過程ｂ．該データからの予測 該正規化されたデータからスタートして、キュービックスプライン内挿関数（ cubic spline interpolating function）を使用して０．１Ｃ分解能で該データ は内挿補間される。次いで該内挿されたデータの対数が取られ、次いで２．５度 （すなわち０．１℃で２５の点）上でサビツスキーゴレイの平滑化アルゴリズム を用いて平滑化される。温度に対する該ログの蛍光の負の導関数が取られ｛−ｄ （ｌｏｇＦ）／ｄＴ｝、サルモネラ用データ範囲：８２．０℃−９３．０℃（１ ２データ点）を用いて１．０Ｃ間隔でパース（parsed）された。 方法比較用に、ここに説明された方法は２つの他の良く知られたモデリング方 法：ニューラルネットワーク及びロジスティック回帰（logistic regression） 、と比較され、結果は下表で報告される。 見出された最も有効なＤＮＡフラグメント同定法は２つのモデリングスキーム をシーケンシャルな仕方で背中合わせで使うことを含んでいる。同定の第１レベ ルはスメア（smear）を非スメア（non-smear）から分離することである。これに 、非スメアサンプル用に関心のある特定のデーエヌエイフラグメントを同定する ことが続く。実際は、この階層的方法は、起こり得る出力カテゴリーを表す正、 負そしてスメアを有する１つの３状態モデルを使用するより精確であった。 １．特定ピーシーアールフラグメントに対する非特定ピーシーアールフラグメン トのモデリング 該ピーシーアールアンプリフイケーション過程（PCR amplification process ）は、関心のあるデーエヌエイの特定の種類に対応するフラグメントのみならず 非特定ピーシーアールフラグメントも作る。第１例は本方法の該非特定と特定の ピーシーアールフラグメント間を区別する能力を展示する。１４９のロックされ たプロセス（すなわち、対照）特定的トレーニングスペクトルと、問題食料（ピ ーシーアール用で問題があると知られる実際の食料）の３０９のテストスペクト ルと、一緒に３０の非特定的又は”スメア”の蛍光スペクトルのグループが創ら れた。０．１℃の温度分解能を有して、１１１点を含む各サンプル用の温度スペ クトル（１１．１℃の範囲上の）が創られた。該ロックされたプロセスと問題食 料サンプルの両者が陽性と陰性の標本を含んだ。この例で、該陽性のサンプルは 特定のバクテリヤ（例えば、サルモネラ）でスパイクされ（すなわち汚染され） そして陰性のサンプルはスパイクされぬ（汚染されぬ）ようにされた。該スメア サンプルはロックされたプロセストレーニング集合（１２スメアサンプル）と問 題食料テスト集合（１８スメアサンプル）の両者にランダムに導入された。該陽 性及び陰性の両サンプル状態は合併され２進のゼロ”０”文字でラベル付けされ 、該スメアサンプル状態は２進の１”１”でラベル付けされた。 ａ．入力の最も情報豊富な集合を発展させること モデリング過程の第１歩は１１１次元の入力フイーチャー空間をより少ない、 より情報豊富な部分集合に減じることである。前に説明した発展型フレームワー クが該最も情報豊富なフイーチャーを発展させるために使用された。１００の遺 伝子の初期遺伝子プールがランダムに発生され、そこでは各遺伝子は２進の１１ １ビットの長さの記号列を有し、各ビットの状態は該対応入力フイーチャーが該 遺伝子内で賦活されたかどうかを表している。該発展過程はセル当たり１サンプ ルとなるべき平均セル占有数（mean cell occupation number）により抑えられ 、そして該発展は５世代より多く進んだ。各遺伝子の発展をドライブするために 、グローバルエントロピー、又は適応度関数としてローカルエントロピーの数加 重和（number-weighted-sum of local entropies）が使用された。該発展は固定 サイズ化された部分範囲（すなわち、適応型ビニングよりむしろ、固定されたビ ン）を使用して進みそして該データは、上記説明の様に、０及び１の出力状態の 数をバランスさせるようバランスさせられた。 発展型過程を通して該１００の最も情報豊富な遺伝子のグローバルリストが保 持された。全ての１１１の入力フイーチャーのビット頻度のヒストグラムが、発 展した該情報豊富な遺伝子プール内で最も屡々発生するビットを同定するために 、該発展の各世代の終わりで分析された。このヒストグラムはどの温度点が該出 力状態に最も密接に付随したかについての情報を提供した。 該１１１の点の温度範囲が０から１１０までインデックス（indexed）され、 下記３１温度点が該発展型過程から選択された：１２，１４，１６，１８，２０ ，２２，２４，２６，２８，３０，３２，３４，３６，３８，４０，４２，４４ ，４６，５０，５２，５４，５６，５８，６０，６２，６４，８０，８２，８４ ，８６，８８。 情報豊富な領域が該ヒストグラム内で観察されそしてこれらの領域に懸かる偶 数番号インデックス点（上記リスト）が選択されたことは注意されるべきである 。大抵の該選択された点が１２から６０の範囲に懸かることは注意されるべきで ある。これは該スメアサンプル用溶解曲線スペクトラムが該ベースライン上に立 ち上がりそして該インデックス間隔［１２，６０］に対応する温度範囲内の陽性 及び陰性両サンプルから別れ始めるからである。例えスメアがそれらの正に規定 により可変溶解曲線構造を有するとは云え、主な構造的フイーチャーは該陽性の サンプル内よりも低い温度で一般に現れる。該陰性のサンプルは本質的に構造か ら自由である。かくして、本方法はより低い温度領域がスメアと非スメアの間の 最良の区別が起こる場所であることを確認する。, zombie apopalypse オンラインスロットをプレイ. ｂ．パース（parsed）されたデータの全低次元射影のエグゾーストな探索 第１発展型過程で発見された該情報豊富な点を使って該トレーニングデータ集 合がパースされた後、該減少したデータ集合は広いビニング範囲に亘り低次元で エグゾースチブに探索された。固定ビンとデータ集合バランシングが該エグゾー スチブな過程を通して使用された。このモデリング問題で、次元当たり２６の固 定ビンを使用して全２次元射影内への該３１次元入力空間の４６５の射影を発生 することが該最良エグゾースチブモデルに帰着することが分かった。Ｗ l 2 ＝１０ 、Ｗ l ＝５，定数項＝１のエントロピー加重係数が使用された。しかしながら、 全４６５の射影を使用する該エグゾースチブモデルは、該射影の多くが情報より 多くのノイズを導入するので、最適モデルであることを保証されない。それで、 各ビットが該モデル用遺伝子プール内の与えられた２次元射影の包含（inclusio n）（２進で１）と排除（exclusion）（２進で０）を表す４６５ビットの長さの ２進記号列を使って第２の発展段階が行われた。 ｃ．最良２次元モデルを発展させること １００のランダム２進記号列が最初に発生されそしてそれらの適応度関数がテ ストデータ集合内誤差を該発展型過程をドライブする適応度関数として使用して 計算された。該モデルは２０世代より多く発展させられそして最も情報豊富な遺 伝子のグローバルなリストが保持された。最後に、この遺伝子プール内の最も情 報豊富な遺伝子（最小テスト誤差に帰着する遺伝子に対応する）がスメア検出用 遺伝子コードとして選択された。この遺伝子は該包含２次元射影の１６３を有し 残りの射影は排除された。これらの１６３の射影を使用した最小テスト誤差は該 ３２７テストケースから３つのエラー（3 errors out of the 327 test cases） （３０９問題食料サンプルと１８スメアサンプル）であって９９％より高いモデ ル精度に帰着する！ ２．陰性のサンプルに対する特定のサルモネラピーシーアールフラグメント（陽 性の）のモデリング ピーシーアールモデリングの第２例として、本方法は食料サンプル内サルモネ ラに対応する特定のデーエヌエイフラグメントを同定するタスクを与えられた。 もう１度、該ロックされた過程スペクトルが該トレーニングデータ集合として使 用されそして該問題食料スペクトルが該テストデータ集合として使用された。上 記説明のものと同様な過程が最良予測モデルを発展させるために使用された。 ａ．入力の最も情報豊富な集合を発展させること 前の例で説明されたそれと同様な手順に従い、本方法は、下記の温度点： １０，１３，１６，６１，６４，６７，７６，７９，８２，８５，８８，９１ に対応する１２入力フイーチャーの集合を発展させた。 この例では、スペクトルの情報豊富な部分は該温度範囲のより高い端（点６１ から９１の間）内にあることを注意する。これは余り驚くべきことではないが、 それはポジテイブな（positive）溶解曲線内の主な構造が温度インデックス（te mperature index）８０の周辺で起こるからである。 ｂ．パースされたデータの全低次元射影のエグゾースチブな探索 第１発展過程で発見された該情報豊富な点を使用して該トレーニングデータ集 合がパースされた後、減少したデータ集合は広いビニング範囲上で低次元でエグ ゾースチブに探索された。固定ビンとデータ集合バランシングが該エグゾースチ ブな過程を通して使用された。このモデリング問題で、次元当たり１９の固定ビ ンを使用した全３次元射影内への該１２次元入力空間の２２０の射影を発生する ことが最良エグゾースチブモデルに帰着することが分かった。前のサンプルでと 同じエントロピー加重係数が使用された。この例で、全ての２２０の射影を使用 することが最良モデルに帰着することが分かった。該２２０の射影の部分集合を 発展させることは該テストデータ集合に関する予測精度を改良しなかった。全２ ２０の射影を用いて、該３０９の問題食料テストサンプル（スメアなしで）から の３０１が９７．４％の精度で適当と同定された。 結果 これらの実験中作られた該３０９のデータサンプルの中で、２０４はサルモネ ラでスパイクされそして１０５のサンプルが”ブランク（blank）”反応であっ た。該２０４のスパイクされたサンプルの中で、１４３のサンプルはアガロース ゲルで陽性でありそして６１は該ゲルで陰性であった。該陰性のサンプルはピー シーアールの禁止か又は不適当なゲルか又はピーシーアール感度の結果と考えら れ得る。該１０５の”ブランク”の反応の中で、９５は該ゲルに関し陰性で、そ して１０は該ゲルに関し陽性であった。該陽性のサンプルは自然の食料汚染（例 えば、液状卵サンプル）又は技術的誤りの結果と考えられ得る。 長所. どんな仮想通貨でもビッグなウェルカムボーナスを進呈 最高のトロンカジノの一つ ボーナスの支払いは「分割」で受け取ることも可能 サインアップボーナスの賭け条件をクリアする期間は60日と長い 毎週開催されるフリースピンとリロードボーナスあり スポーツベットとeスポーツも利用可. 短所. イギリスとアメリカでは利用不可（日本は可能） クリプトアセットはボラティリティの高い非規制の投資商品です。 2. 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